据统计，截至目前已知的遗传性疾病达余种，但绝大部分疾病都缺乏有效的治疗药物和方法。如今，包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas13、单碱基编辑等新型基因编辑技术的出现为这类疾病的治疗带来了希望。利用基因编辑技术对目的基因进行精确操作，实现基因定点替换、敲除或敲入，在分子水平上对致病基因进行编辑和修改。
以CRISPR-Cas13为例，这是一类由RNA介导的靶向RNA的基因编辑技术。先前的研究表明，CRISPR-Cas13系统已经被证明可以在哺乳动物细胞中对靶RNA进行高效且特异性地敲低。然而，Cas13普遍存在旁切活性，会造成脱靶效应，并且还可能会存在毒副作用，这成为Cas13走向临床应用所面临的最大障碍。
因此，如何降低或消除Cas13蛋白的旁切活性，开发更特异的高保真Cas13蛋白对基于RNA编辑的基因治疗策略研发和后续临床转化具有重要意义。
近日，辉大基因、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杨辉团队，利用蛋白质工程、流式细胞术、体外切割实验、全转录组测序等技术手段，对Cas13进行蛋白工程化改造、优化、筛选及验证，开发出了具有高效编辑活性和低旁切活性的高保真Cas13蛋白突变体hfCas13d、hfCas13X.1(辉大基因独有）。这项研究对基于RNA编辑的基础研究、基因治疗策略开发以及临床应用打下了基础。
目前，这项研究发现已经以“High-fidelityCas13variantsfortargetedRNAdegradationwithminimalcollateraleffects”（靶向RNA且极低旁切活性的高保真Cas13变体）为题发表在NatureBiotechnology上。
（来源：NatureBiotechnology）
“相较于Cas9介导的DNA编辑技术，基于Cas13的RNA编辑工具靶向动态转录的RNA，不会对基因组造成永久性改变，而且可以通过剂量调整等方式控制RNA编辑效果，具有可逆性，相对来说更加安全。”该论文的通讯作者、中国科学院神经科学研究所研究员杨辉博士告诉生辉。
年，杨辉本科毕业于上海交通大学生物技术学院，随后，他进入中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物研究所攻读博士学位，师从李劲松教授，研究方向为胚胎和干细胞领域。年，他进入美国麻省理工学院Whitehead研究所从事博士后研究工作，期间，他和团队构建出全球第一只CRISPR-Cas9基因编辑小鼠。
年，杨辉回国并担任中国科学院神经科学研究所研究员、灵长类疾病模型研究组组长，早期的研究方向是基于CRISPR技术在胚胎阶段的优化，后续开展了一些临床合作，如用AAV载体递送CRISPR基因编辑系统等，同时，他还曾获得国家优秀青年科学基金和国家杰出青年科学基金的资助。
▲图｜中科院神经科学研究所研究员杨辉（来源：受访者）
“筛选出高保真Cas13突变体，具有高编辑活性和低旁切活性”
Cas13蛋白属于多结构域单一蛋白RNA内切酶，先前的许多体外研究表明，Cas13蛋白激活后不仅能够对靶RNA进行切割，还能对其周围的任意RNA进行非特异性切割。
在这项研究中，杨辉团队首先开发了基于绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（mCherry）的双荧光筛选系统，用于在哺乳动物细胞中检测Cas13蛋白的旁切效应。基于该系统，团队设计靶向绿色荧光蛋白的mRNA的编辑系统，同时检测红色荧光蛋白的表达水平来表征旁切效应，结果他们发现Cas13d与Cas13a蛋白的激活都能诱导出非常显著的旁切效应。
▲图｜hfCas13d蛋白的工程化设计、筛选及脱靶效应验证（来源：NatureBiotechnology）
为了降低或消除Cas13d蛋白的旁切活性，研究人员预测并对比分析了Cas13d的蛋白结构，并推测旁切效应的产生是因为Cas13蛋白与gRNA结合后，其核酸酶活性被激活，结构发生变化，核酸酶活性位点就会暴露在蛋白表面，继而对周围的RNA进行任意切割。
接下来，他们通过蛋白质工程对Cas13d进行一系列突变改造，从而改变它与非靶RNA的相互作用，并结合哺乳动物细胞转染、流式细胞术等手段，筛选出了一些具有高效编辑活性且旁切活性显著降低的Cas13d突变体，其中Cas13d-N2V8变体表现出了较好的特异性，是一种高保真Cas13蛋白突变体（hfCas13d）。
最后，杨辉团队进行了试验验证，通过对大量内源基因位点进行RNA敲低试验发现hfCas13d表现出与常规Cas13d同样的高活性，与此同时，他们结合体外切割实验、全转录组分析、稳转细胞系、转基因小鼠、在体靶向RNA敲低等技术，对hfCas13d进行了系统性的脱靶效应验证，以及有效性和安全性评估。
▲图｜hfCas13d蛋白在哺乳动物细胞及个体有效性和安全性评估（来源：NatureBiotechnology）
“整个研究的核心，是这套双荧光筛选系统的建立，一个荧光指示靶向活性，一个荧光指示旁切脱靶活性。通过流式分选可以高效、大通量筛选各种Cas13d的突变体，最后我们得到一种高保真的Cas13d的突变体，其靶向活性较高，能有效降解靶RNA，而且没有旁切效应，动物试验也显示非常安全。”杨辉总结道。
这项研究开发出了具有“高效编辑活性”且“极低旁切活性”的高保真Cas13d突变体——hfCas13d，这种新工具展现出了更高的特异性和安全性，为接下来基因疗法的开发提供了新途径。
谈及开展这项研究的初衷，杨辉表示，“当时我们观察到用Cas13d蛋白进行转基因小鼠试验会导致小鼠死亡，那后续的基础研究和临床应用就都很难继续展开了，所以我们就想着力去解决这个问题，通过各种方法进行尝试。”
长期以来，杨辉课题组专注于Cas13系统的开发，值得一提的是，他和团队自主开发的Cas13X和Cas13Y于今年1月获得美国专利局的授权。“其实Cas13Y的旁切效应要比Cas13d低很多，虽然这项研究是针对的Cas13d和Cas13X，而用我们开发的这套策略也可以在Cas13Y上进行开发，我们的这套策略是具有普适性的。”杨辉指出。
（来源：Pixabay）
谈及下一步的研究动向，杨辉表示，“在很多小动物模型上，我们已经看到了RNA编辑技术的治疗效果其实不输Cas9，而且它的特异性较好，也比较易于递送（比如AAV即可进行递送）。所以，接下来我们首先需要找到Cas13的一些适应症，然后将其全力推向临床，这个是现阶段我们最大的一个目标。”
“其次，我们可能会做一些药物诱导的可调控的RNA编辑，即可调控，在我们需要的时候进行基因敲低，不需要的时候撤药，基因恢复正常表达水平，从而实现靶标RNA实时、可逆化调控。”他说道，“再次，可以实现多位点编辑。每增加一个位点，碱基对可能只会增加50bp左右，所以我们可以轻松增加3~4个位点。”
据杨辉介绍，现阶段正在开展的适应症——MECP2重复综合征（MECP2duplicationsyndrome,MDS），他们在小鼠中发现通过调控MECP2可以达到疾病治愈的目的。“我们目前在一些听力疾病、眼科疾病，以及神经系统疾病都观察到很好的体内治疗效果。下一步，我们将进一步在猴模型上验证。同时，我们首先会聚焦于解决一些罕见病，然后会进一步拓展到更广泛性的疾病。”他说道。
“开发底层专利技术打破海外技术封锁”
相较于DNA编辑工具，杨辉总结了RNA编辑工具的几个优势：
第一，相对较小。“DNA编辑工具，Cas9蛋白包含约个氨基酸，而RNA编辑工具则要小很多，很容易通过AAV载体进行递送。”他指出。
第二，可逆性。“因为RNA编辑工具是可逆的，发现效果不好可以进行关闭，而DNA编辑工具的改变则是永久性的，是不可逆。”杨辉补充道。
第三，可调控。比如，MECP2重复综合征是由MECP2基因重复所致，然而该基因过多或过少都会导致患病，RNA编辑工具可以很好的控制剂量，保证不会敲低过多或过少，但是DNA编辑工具却无法实现。
围绕RNA编辑技术，杨辉已于年创立了辉大（上海）生物科技有限公司（简称辉大基因），专注于罕见单基因遗传病以及威胁人类健康常见疾病基因治疗药物的研发和生产。
▲图｜辉大基因（来源：公司