李文林
副主任，教授，博士生导师
第二*医大学基础部细胞生物学教研室副主任、教授、博士研究生导师；国家自然科学基金优秀青年科学基金和英国皇家学会“牛顿高级学者（NewtonAdvancedFellowship）”基金获得者，入选上海市“优秀学术带头人”、上海市“浦江人才”计划和“曙光”计划。先后在第二*医大学获得药学学士、药物化学硕士、生物化学和分子生物学博士学位。至年赴美国斯克利普斯研究所（TheScrippsResearchInstitute）从事博士后研究。目前以利用化学生物学手段干预和调控多能干细胞和成体干细胞的定向分化与自我更新为主要研究方向。近年来，作为第一作者或通信作者在包括CellStemCell、PNAS、Hepatology、ScienceTranslationalMedicine和StemCells等在内的杂志已发表论文和综述共14篇。
干细胞研究中的化学生物学：学科交叉的新前沿
李文林，张冠宇，孙平新
第二*医大学基础部细胞生物学教研室，上海
摘要
化学生物学（chemicalbiology）是利用小分子化合物干预和解析生物系统，认识生物系统的本质和内在规律的学科，在包括干细胞研究在内的多个领域得到应用。近年来，干细胞研究取得了引人瞩目的进步，这些基础研究的进步也正在推动着干细胞技术在再生医学中的应用。对细胞命运转换分子基础的认识以及精确操控是干细胞研究的核心问题。小分子化合物因其在使用的便捷性、可控性和功能多样性等方面的显著优势，正越来越多地被用于干预和研究干细胞的增殖、分化和重编程等生物学行为。利用化学分子调控体内干细胞的生物学行为、促进其体内再生和修复将有望成为再生医学领域极具潜力的发展方向。化学生物学（chemicalbiology）是利用化学小分子化合物干预和解析生物系统，认识生物系统的本质和内在规律的交叉学科。传统遗传学手段依赖于基因突变干预和解析生物系统，化学生物学则利用活性的小分子化合物干预蛋白质功能从而影响生物学系统。与遗传学手段相比，化学小分子具有使用便捷、活性可以通过化合物浓度和不同组合进行精确调控以及作用具有可逆性等显著优点，已经成为研究生物体系的重要工具。近年来，干细胞研究取得了引人瞩目的进步，对细胞命运转换分子基础的认识以及精确操控一直是干细胞研究的核心问题。由于干细胞的自我更新和分化等基本生物学行为是一个高度时空依赖的调控过程，化学生物学手段的灵活性和高度可控性尤其适合干细胞研究。传统的遗传学手段大致可以分为“正向遗传学（forwardgenetics）”和“反向遗传学（reversegenetics）”两类。化学生物学与之类似，“正向化学生物学”手段是一种发现驱动（discoverydriven）的研究手段。例如，对干细胞研究领域而言，如果拟解析细胞命运A到细胞命运B转换的分子基础，首先通过化学筛选发现可以诱导细胞命运Ａ向细胞命运B转换的化合物，然后分析该化合物的作用靶点和机制，从而认识细胞命运A到细胞命运B转换的分子基础。而“反向化学生物学”手段是一种假设驱动（hypothesisdriven）的研究手段，需要建立在对细胞命运A向细胞命运B转换的分子机制有一定认识的基础上，通过推理和设计用已知功能化合物对细胞命运转换的关键调控机制进行干预，从而实现由细胞命运A获得细胞命运B（图1）。
本文将评述近年来利用化学生物学手段干预和调控干细胞命运的重要进展，立足于利用典型的研究工作归纳化学生物学在干细胞研究中的应用策略，以及其对干细胞生物学的基础研究和转化应用所产生的重要而深远的影响。
1发现驱动的化学生物学手段在干细胞研究中，发现驱动的化学生物学手段通常利用小分子化合物库进行细胞表型筛选（phenotypicscreening），发现并验证能够诱导细胞获得特定表型的化合物，并进一步研究化合物的作用靶点和机制。通过该策略，一方面可以为干细胞命运调控提供有用的化学工具分子，另一方面可以通过对化合物作用靶点的研究探究未知的生物学机制。该方法通常是一种无偏的（unbiased）化学筛选策略，即对小分子的可能作用机制没有预先的设定；此外，在实验设计上不会受限于对拟干预的生物学过程认识的不足，因此非常适合用于解析干细胞生物学中的未知问题。本部分将从干细胞自我更新、体细胞重编程等不同角度对发现驱动的化学生物学进行评述。
胚胎干细胞（embryonicstemcells）的自我更新（selfrenewal）是干细胞研究的热点问题。对小鼠胚胎干细胞而言，LIF/STAT3、BMP4/Smad和Wnt/β-Catenin介导的信号通路在细胞的自我更新中发挥核心作用［1-2］。但是否还存在其他决定性的分子机制在其中发挥作用呢？Chen等[3]设计了一个高通量化学筛选的策略，他们将小鼠胚胎干细胞培养于无血清、无饲养层细胞、无任何细胞因子添加的培养基中，该条件本身无法维持胚胎干细胞的自我更新，但是通过高通量化学筛选他们从超过５万个化合物中发现其中一个杂环小分子化合物SC1可以在此条件下维持小鼠胚胎干细胞的自我更新。进一步的机制研究证实SC1并不激活LIF/STAT3、BMP4/Smad或Wnt/β-Catenin信号通路，而是通过结合并抑制可促进胚胎干细胞分化的分子ERK和RasGAP来促进小鼠胚胎干细胞的自我更新。该研究表明在抑制了促进分化的因素后，小鼠胚胎干细胞可能本身具有内在的自我更新能力，这一研究深化了人们对鼠胚胎干细胞自我更新机制的认识。
实现干细胞在体外的自我更新具有重要的生物学意义和应用价值。但是，相对于胚胎干细胞而言，目前人们对绝大多数成体干细胞自我更新分子基础的认识都非常有限。例如，造血干细胞移植已经在临床中应用超过半个世纪，但是仍然无法有效地实现体外造血干细胞的自我更新，从而解决造血干细胞移植时细胞来源匮乏的问题。Boitano等[4]以CD34和CD阳性的造血干细胞扩增为指标，从10万个化合物中发现阳性化合物StemRegenin1（SR1）可在IL-6、FLT3配体和SCF等细胞因子存在的条件下，将CD34阳性细胞的扩增效率提高50倍、将能重构NOD/SCID小鼠造血系统的细胞数提高17倍，机制研究证明SR1是芳香烃受体（arylhydrocarbonreceptor，AHR）拮抗剂，该研究首次揭示了AHR在造血干细胞自我更新中的作用。此后，Sauvageau研究团队[5]筛选了可以扩增脐带血中CD34(+)CD45RA(-)表型长周期造血干细胞的化合物，获得的阳性化合物中除了包含AHR拮抗剂外，还发现了一类嘧啶吲哚（pyrimidoindole）衍生物，其可以在体外有效扩增人长周期造血干细胞。该类化合物并不抑制AHR，其作用靶点尚不清楚。与AHR拮抗剂SR1相比，嘧啶吲哚衍生物更倾向于扩增长周期造血干细胞，其代表化合物UM已在进行脐血扩增的临床研究（NCT）。有趣的是，无论是SR1还是UM都不能扩增小鼠的造血干细胞。
体细胞重编程是近年来干细胞研究领域的重大突破，日本科学家YamanakaS因此获得了年诺贝尔生理学或医学奖。通过高表达外源的转录因子，如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，可以将分化的体细胞重编程为类似胚胎干细胞的诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSCs）[6-8]。利用此技术，可将患者自身细胞重编程为多能干细胞，然后将多能干细胞分化为患者需要的细胞，从而用于疾病治疗，这一方面避免了胚胎干细胞应用所涉及的伦理学争议，另一方面也可以显著缓解异体细胞移植所涉及的免疫排斥问题。但是，过表达外源转录因子诱导的重编程效率低，或者存在外源DNA片段在细胞内稳定整合等问题。体细胞重编程的过程涉及细胞表型的剧烈变化，因此适合用于通过表型筛选发现可促进重编程的化合物。利用Oct4启动子调控绿色荧光蛋白表达作为化学筛选指标，Shi等[9-10]发现，H3K9组蛋白甲基化酶G9a抑制剂BIX可以诱导仅表达Oct4和Klf4的小鼠神经干细胞发生重编程；BIX联合DNA甲基化酶抑制剂RG和L-钙通道激动剂Bayk-，可以诱导仅表达Oct4和Klf4的小鼠成纤维细胞发生重编程。因G9a在多能干细胞分化过程中介导了Oct4和Rex1等多能性基因的沉默[11]，在重编程过程中抑制G9a可能有助于Oct4等基因的重新启动。我们的研究还发现，GSK3抑制剂CHIR和H3K4/9组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂parnate（也被称为tranylcypromine）的组合可诱导仅表达Oct4和Klf4的人角朊细胞（keratinocytes）发生重编程[12]。其他化学筛选还发现组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸（valproicacid，VPA）和丁酸钠、组蛋白H3甲基化酶DOT1抑制剂等对重编程有促进作用，且VPA可诱导仅表达Oct4和Sox2的人成纤维细胞发生重编程[13-16]。这些研究都表明表观遗传学的重构是体细胞重编程的关键障碍之一。Zhu等[17]通过筛选发现３-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-１（3-phosphoinositidedependentkinase1）激动剂PS48可促进仅表达Oct4的人角朊细胞等体细胞重编程为多能干细胞，其作用机制是PS48通过促进细胞的糖酵解而发挥作用。该研究揭示了细胞能量代谢从氧化磷酸化到糖酵解的转化是体细胞重编程过程的重要机制。Hou等[18]和Zhao等[19]利用表达Sox2、Klf4和c-Myc的小鼠成纤维细胞进行化学筛选，发现forskolin等化合物可以在无外源Oct4基因的条件下诱导小鼠细胞重编程为iPSCs。在此基础上，他们利用forskolin联合其他可以提高重编程效率以及取代Sox2、Klf4和c-Myc的小分子化合物，发现一个包括forskolin、VPA、CHIR、（TGFβ受体抑制剂）和parnate的小分子组合可以在无任何外源转录因子存在的条件下诱导小鼠成纤维细胞表达多能干细胞核心转录因子Oct4，建立和优化了仅用化学小分子诱导小鼠体细胞重编程的技术体系。通过分析化学诱导的重编程过程，他们发现该重编程过程经历了一个胚外内胚层的中间阶段，最终获得多能性，这与Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子诱导的重编程要经过类似原条（primitivestreak）的中间阶段不同[19]。
化学生物学手段在干细胞研究中已经得到了越来越多的