目的
包括WZ，CO-和AZD在内的针对特定突变类型，不可逆的第三代EGFR-TKI对于发生吉非替尼/厄洛替尼耐药突变TM的肺癌患者及临床前模型中是有效的。但是，目前关于肿瘤对于这类EGFR酪氨酸激酶抑制剂的获得性耐药进展的研究很少。为此，我们尝试探寻研究和找出针对此类第三代EGFR-TKI的EGFR突变。
实验设计
我们进行了针对EGFR突变（单独敏感突变或伴随TM突变）的Ba/F3细胞的亚硝基乙基脲（NEU）诱变筛选并选择出耐药的克隆。我们评估了EGFR-TKI在伴随耐药突变的EGFR突变模型中的敏感性。
结论
我们发现了3种主要的药物耐药突变，EGFRLQ，LV和CS突变都导致对WZ和CO-的耐药。相比之下，只有CS突变作用于AZD的耐药机制。产生L突变，LV突变或CS突变同时伴随EGFR敏感突变（如19外显子缺失或LR突变）的细胞对于一代EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼仍然敏感。存在19缺失/LR加上TM以及CS突变的情况下对目前所有EGFR-TKI耐药，但是LR/TM/CS仍保留对Ctuximab的部分敏感。
总结
我们的发现提供了针对第三代EGFR-TKI耐药机制的认识，并鉴定出对现有临床EGFR-TKI仍然有效的特定基因组合。这些研究也许会对未来EGFR-TKI治疗新策略的发展提供指导。
转化医学相关性
进行EGFR-TKI治疗后，最常见的获得性耐药的发生机制是TM突变的出现。目前对此的治疗策略包括嘧啶类针对特定突变的EGFR抑制剂，至今为止这些药物可以使大部分由于发生TM突变导致耐药的肺癌患者肿瘤缩小。通过体外模拟药物耐药过程，我们发现导致针对化合物WZ以及临床化合物AZD和CO-发生相关耐药的EGFR突变。这些发现也许会帮助预测可能在临床中出现的获得性耐药机制，以及用于潜在的以后可以在临床中应用的治疗策略研究。
鉴定出新的药物耐药位点：为了找出可能导致对WZ产生耐药的突变位点,我们使用了先前提到过的ENU诱导突变筛选法。将携带常见EGFR敏感突变（LRandDlE_A）或伴随TM突变的Ba/F3细胞，在进行nmol/L或1mmol/L浓度的WZ中进行ENU处理2周后选择出耐药的克隆。在四中不同的细胞株中发现了三种突变：
LQ(codon,TA),LV(codon,CG),和CS(codon,TA)
C位点是和WZ共价结合的位点。若发生突变，则会导致药物耐药。LV突变先前已经在一位非小细胞肺癌患者上被观察到。位于L位点的LP，LV和LM突变先前已被发现，但是EGFRLQ并未发现过。这些突变目前的临床意义还未明确。我们接下来也验证了是否LQ和LV突变是致癌性的突变并且导致了耐药，抑或只是后者。TM突变既是致癌突变同时又引起了对药物的耐药。而EGFRLQ和LV都不足以导致IL3-独立细胞在EGFR野生型背景的生长（图1B）。有意思的是，虽然这些突变导致对WZ的耐药，但是他们对不可逆的喹唑啉基EGFR抑制剂阿法替尼、nratinib和CL-、仍然敏感（如图1C）。通过抑制EGFR磷酸化导致对这些Ba/F3细胞的生长抑制。吉非替尼作为一种可逆的喹唑啉基EGFRTKI，在LV模型中有更好的疗效（图1C）。但我们没能在DlE_ABa/F3细胞中使用ENU诱导筛选方法鉴定出二重突变(图1A)。处理过的EGFRDlE_A/LQ而不是EGFRLR/LQ的Ba/F3细胞展示了一种生长劣势，从而解释了为什么这类突变没有在以前的方法中被发现（图1D）。在出现LQ突变后，EGFRDlE_A细胞的EGFR磷酸化被抑制也支持了这个观点。
图1探寻EGFR癌基因以外的新耐药机制。
A,使用WZ从Ba/F3细胞ENU分选鉴定到的EGFR二次突变类型；B,发生EGFRLQ和LV缺失EGF或IL3的Ba/F3细胞没有继续生长；C,发生EGFRLQ和LV的Ba/F3细胞仍然对三代TKI敏感。将细胞放置在不同药物指定浓度下处理，在72小时测量到活体细胞，并和对照组比较。WB免疫印迹表明,放置16小时后，3T3细胞表达出不同的结构。将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；D,携带EGFRDl1/LQ突变的Ba/F3细胞有生长劣势。在缺失或存在EGF/IL3的细胞前后数量一致。在指定时间三次重复测量细胞数量
图2EGFRLQ和LV与WZ的结合影响对第三代EGFR-TKI的敏感性。
A,EGFRTM与WZ结合空间结构(PDBCod3IKA).。L和L位点都与抑制剂直接接触,并与C形成共价键；B,结构模型说明了LQ和LV突变导致耐药。位于的谷氨酰胺侧链本应在空间上影响与WZ的结合,但是位于的缬氨酸变化改变了与TKI的结合；C,EGFRLQ和LV突变减弱了与WZ的结合；D,Dl/TM/LQ以及Dl/TM/LV在Ba/F3细胞对所有已知的TKI耐药；E,Dl/LQ和Dl/LV双突变的Ba/F3细胞仍然对喹唑啉基TKI敏感；F,吉非替尼/WZ单独以及组合进行ENU处理和分选Ba/F3细胞发生的EGFR二次突变汇总。
G,WZ和吉非替尼的结合对EGFRLR/LQBa/F3细胞有效
临床上针对不同突变类型的EGFR抑制剂在含有EGFR突变的细胞模型中的不同疗效：我们得到的WZD只是作为一种化合物，与此同时在CO-和AZD已然开展了临床试验。但是我们还是比较了三种共价键作用的药物单药和阿法替尼在Ba/F3细胞模型以及含有EGFR敏感突变（同时伴随或未伴随TM突变）的原生NSCLC细胞株中的疗效。四种药物都对包含EGFRDlE_A和包含LR的细胞有效，然而WZD，CO-和AZD显著在含有TM突变的模型中比阿法替尼疗效更好。没有任何一种药物对于携带CS突变或20外显子插入A_VdupASV的三重突变模型有效。对于突变野生型的细胞来讲，阿法替尼是稍好一点的抑制剂，AZD在EGFR野生型中比WZ或CO-浓度更低(图3A)。类似的趋势也在内源肺癌细胞株中观察到。在包含TM突变的内源肺癌细胞株中，包括PC9GR4（携带E_A/TM突变）细胞中，AZD是最有效的抑制剂（图3B）。与此对应的，是AZD在这些细胞中抑制EGFR磷酸化和下游信号比WZ或CO-更低的浓度（图3B）。
图3第二代和第三代TKI比较。
A,阿法替尼在野生型细胞中更有效，将细胞放置在不同药物的指定浓度下处理，72小时测量到活体细胞，并和对照组比较。WB免疫印迹表明,放置16小时后，3T3细胞表达出不同的结构。将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；B,AZD是PC9GR4(伴随Dl19/TM突变)细胞株中最有效的抑制剂并且其有效性反映了EGFR的磷酸化效果及下游信号
临床上不可逆的EGFR抑制剂在伴随EGFR第三重突变的模型上的疗效：我们接下来评估了是否临床不可逆的EGFR抑制剂在含有EGFR三重突变的模型中有不同的疗效。阿法替尼在一个携带EGFR敏感突变（LR或Dl19）和LQ或LV突变的模型中是最有效的（图4A和B）。对于嘧啶类抑制剂来说，只有AZD抑制了携带Dl/LQ、Dl/LV和LR/LV突变的细胞。但是对于LR/LQ效果有限（图4A）。在三重突变的Ba/F3细胞中，只有AZD对于携带LV突变的模型有效，但对携带LQ突变的细胞只有极小的效果（图4A）。我们还重复比较了3种不可逆嘧啶类EGFR抑制剂在的nmol/L或1mmol/L浓度差异（图4D）。多重突变细胞在nmol/L浓度的WZ和CO-处理下恢复生长，而90%克隆在AZD作用下发生CS突变（图4D）。在1mmol/浓度LWZ和AZD作用下，只有包含C位点（CS或CG）突变的克隆恢复生长。而大致相等数量的LQ和CS克隆在CO-作用下恢复生长（图4D）。携带QR（codon,AG）突变的细胞对W和CO-不敏感，但是对AZD和阿法替尼敏感。
图4WZ,CO-,和AZD对于EGFR三重突变有不同的效果。
A,存在EGFR突变的EGFR单独敏感突变或同时伴有EGFRTM突变的Ba/F3细胞IC50对照。afatinib和AZD都对EGFR敏感突变伴随LQ/LV突变的细胞株有效。只有AZD是对EGFRLR或Dl19/TM/LV细胞有效的；B,表达EGFRDl19/LV的NIH-3T3细胞被放置在不同药物指定浓度下16小时，将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；C,表达EGFRDl19/TM/LQ或Dl19/TM/LV的NIH-3T3细胞被放置在不同药物的指定浓度下处理。将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；D,WZ、CO-及AZD分别在nmol/L或1mmol/L的浓度进行ENU处理和分选Ba/F3细胞发生的EGFR二次突变汇总
现存EGFR抑制剂在一些包含EGFRCS的基因类型中仍然有效：在得到了CS突变对于WZ、CO-和AZD潜在的耐药后，我们接下来评估了是否CS导致的耐药与基因组结构相关。表达EGFR敏感突变和CS的Ba/F3细胞在不存在EGFRTM突变时仍然对阿法替尼敏感（见图4A）。同样地，当PC9细胞（EGFRE_A）对WZ、CO-和AZD产生耐药表达EGFRDlE_A/CS时，它们仍然对阿法替尼和吉非尼敏感（图6A和B）。更重要的是，尝试对ENU诱导突变分析携带EGFRLRBa/F3的细胞使用吉非替尼单药、AZD单药或联用，发现在吉非替尼和AZD治疗下没有出现任何耐药克隆（图6C）。先前的研究说明了在一些EGFR突变的蛋白质，包括LR/TM，并不需要二聚体的致癌性转化。与此相反，其他突变包括EGFRLR，需要形成二聚体，而且对ctuximab敏感，皆因为其阻断了EGFR形成二聚体。得到这样的发现后，我们评估了在Ba/F3细胞中是否存在像单倍体或二倍体转化的三倍体EGFR突变蛋白。当LR/TM/LQ突变和LR/TM/LV突变主要存在于单倍体，LR/TM/CS既存在单倍体也发现了二倍体（图6D）。ctuximab的治疗阻断了二聚体形成，也因此导致了EGFR磷酸化抑制以及细胞的生长抑制（图6D和E）。和LR配对不同，Dl19/TM/CS突变主要以单倍体形式存在，所以ctuximab治疗对其EGFR磷酸化和细胞生长没有影响。
图5在EGFR突变的NSCLC细胞株中发现EGFRLQandLV导致耐药
A,PC9GR4(携带Dl19/TM突变)细胞被逆转录病*感染以表达GFP,EGFRDl19/TM/LQ,或EGFRDl19/TM/LV。将细胞放置在不同药物的指定浓度下处理，72小时测量到活体细胞，并和对照组比较；B,将图A中的细胞放置在不同药物下处理，将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；C,表达不同EGFR构型的PC9GR细胞株被放置在含有指定药物的琼脂中持续8天,之后根据厂商的相关协定检测了吸光度。一共重复了三次实验获取实验数据，但都得到相似的结果；D,使用阿法替尼单独、ctuximab单独或二者联用处理PC9GR细胞。将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达
图6包含EGFRCS的细胞在某些基因突变组合中对目前现有的EGFR-TKI仍然敏感。
A,PC9(Dl19)细胞被逆转录病*感染表达GFP或EGFRDl19/CS将细胞放置在不同药物的指定浓度下处理，72小时测量活体细胞，并和对照组比较；B将图A中细胞放置在不同药物的指定浓度下处理，将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；C,吉非替尼单药、AZD单药及二者联合进行ENU处理和分选Ba/F3细胞发生的EGFR二次突变汇总；D,EGFRLR/TM或伴随同时LQ,CS或LV突变的Ba/F3细胞使用ctuximab处理16小时，将细胞提取物进行免疫印迹鉴定蛋白表达；E,细胞被放置在不同药物的指定浓度下处理，72小时测量到活体细胞，并和对照组比较
信息来源：
DaliaErcan,tal.EGFRMutationsandRsistanctoIrrvrsiblPyrimidin-BasdEGFRInhibitors,ClinCancrRs.,21(17):-23.
靶向分子诊断